注意事項(xiàng)：1．基礎(chǔ)程序；2．?dāng)U增溫度和延伸溫度；3．反應(yīng)時(shí)間；4．循環(huán)次數(shù)；5．PCR 反應(yīng)液的配制；6．PCR技術(shù)的基本原理；7．PCR的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)；8．PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；9．PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件。

組成及試劑配制:
1、酶標(biāo)板：一塊（96孔）
2、 標(biāo)準(zhǔn)品（凍干品）： 2瓶，請(qǐng)臨用前15分鐘內(nèi)配制。每瓶以樣品稀釋液稀釋至0.5ml，蓋好后室溫靜置大約10分鐘，同時(shí)反復(fù)顛倒/搓動(dòng)以助溶解，其濃度為200 U/L，然后做系列倍比稀釋?zhuān)ㄗⅲ翰灰苯釉诎逯羞M(jìn)行倍比稀釋?zhuān)謩e配制成200 U/L，100 U/L，50 U/L，25 U/L，12.5 U/L，6.25 U/L，3.12 U/L，樣品稀釋液直接作為空白孔 0 U/L。如配制100 U/L標(biāo)準(zhǔn)品：取0.3ml （不要少于0.3ml ）200 U/L的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含有0.3ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類(lèi)推。
3、 樣品稀釋液：1×20ml。
4、 檢測(cè)稀釋液A：1×10ml。
5、 檢測(cè)稀釋液B：1×10ml。
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實(shí)驗(yàn)過(guò)程：
一、試劑準(zhǔn)備
1. DNA模板
2．對(duì)應(yīng)目的基因的特異引物（在PCR反應(yīng)中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復(fù)制，而不能從無(wú)到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設(shè)計(jì)的引物。可以是DNA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據(jù)你的模板鏈設(shè)計(jì)。因此，擴(kuò)增不同的基因需要設(shè)計(jì)不同的引物）
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步驟
1．在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o(wú)菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer             5μl
dNTP mixl                 4μl
引物1（10pM）               2μl
引物2（10PM）              2μl
Taq酶（2U/μl）            1μl
DNA模板（50ng-1μg/μl）　　　 1 μl
加ddH2O至               50 μl
視PCR儀有無(wú)熱蓋，不加或添加石蠟油。
2．調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴(kuò)增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。
3．結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測(cè)或-20℃長(zhǎng)期保存。
4．PCR的電泳檢測(cè)：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測(cè)。
三、注意事項(xiàng)
１．PCR反應(yīng)應(yīng)該在一個(gè)沒(méi)有DNA污染的干凈環(huán)境中進(jìn)行設(shè)立一個(gè)的PCR實(shí)驗(yàn)室。
２．純化模板所選用的方法對(duì)污染的風(fēng)險(xiǎn)有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結(jié)果，純化的方法越簡(jiǎn)單越好。
３．所有試劑都應(yīng)該沒(méi)有核酸和核酸酶的污染。操作過(guò)程中均應(yīng)戴手套。
４．PCR試劑配制應(yīng)使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過(guò)濾除菌或高壓滅菌。
５．試劑都應(yīng)該以大體積配制，試驗(yàn)一下是否滿(mǎn)意，然后分裝成僅夠一次使用的量?jī)?chǔ)存，從而確保實(shí)驗(yàn)與實(shí)驗(yàn)之間的連續(xù)性。
６．試劑或樣品準(zhǔn)備過(guò)程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應(yīng)洗滌干凈并高壓滅菌。
７．PCR的樣品應(yīng)在冰浴上化開(kāi)，并且要充分混勻。
雷酚內(nèi)酯（標(biāo)準(zhǔn)品）Cas9 (<i>S. pyogenes</i>) (D8Y4K) Rabbit mAb (PE Conjuga)氨基咪唑

雷公藤紅素(標(biāo)準(zhǔn)品)BRSK2 (D29B6) Rabbit mAb2--甲

雷公藤甲素(標(biāo)準(zhǔn)品)Synaptophysin (D35E4) Rabbit mAb2-C-甲基-D-核糖酸-1,內(nèi)酯

雷公藤內(nèi)酯酮（標(biāo)準(zhǔn)品）Synaptophysin (D35E4) Rabbit mAb2-基酸

類(lèi)葉升麻苷,毛蕊花糖苷（標(biāo)準(zhǔn)品）Bafilomycin A12-基酸

利卡靈-B(標(biāo)準(zhǔn)品)Phospho-c-Jun (Ser63) (54B3) Rabbit mAb (Biotinylad)2-溴-4,6-二甲基吡啶

利血平(標(biāo)準(zhǔn)品)Androgen Receptor Antibody (Carboxy-rminal Antigen)1H-1,2,三氮唑-羧酸

櫟櫻酸(標(biāo)準(zhǔn)品)Phospho-Tyrosine Mouse mAb (P-Tyr-100) (HRP Conjuga)羥基-2-酸

連翹苷(標(biāo)準(zhǔn)品)TIM-3 (D5D5R™) XP® Rabbit mAb (Alexa Fluor® 488 Conjuga)L-焦谷氨酸甲酯

連翹酯苷A(標(biāo)準(zhǔn)品)RagC (D31G9) XP® Rabbit mAb吖啶橙

連翹酯苷B（標(biāo)準(zhǔn)品）RagC (D31G9) XP® Rabbit mAb酰酸酯

蓮心（標(biāo)準(zhǔn)品）Synaptophysin (D40C4) Rabbit mAb(三氟甲氧基)基

三尖杉(標(biāo)準(zhǔn)品)BSP II Antibody非諾貝特

遼東楤木皂苷Ⅹ（標(biāo)準(zhǔn)品）TTK (D15B7) Rabbit mAb基磺酰

硫酸氨基葡萄糖（標(biāo)準(zhǔn)品）Anti-mouse IgG (H+L) (DyLight™ 680 Conjuga)6-煙酸酯

硫酸黃連（標(biāo)準(zhǔn)品）Anti-mouse IgG (H+L) (DyLight™ 680 Conjuga)2-煙酰

硫酸軟骨素(標(biāo)準(zhǔn)品)Livin (D61D1) XP® Rabbit mAb茚滿(mǎn)

龍膽苦苷（標(biāo)準(zhǔn)品）Livin (D61D1) XP® Rabbit mAb并呋喃-2-羧酸

酸化蛋白激酶AKT1CD151/MER2/PETA-3/FITC  熒光素標(biāo)記CD151IgG100 ul

ASH1L蛋白CD155/PVR/FITC  熒光素標(biāo)記CD155IgG20 ul

α2C-AR腎上腺素能受體CD160/By55/FITC  熒光素標(biāo)記NK細(xì)胞受體BY55IgG100 ul

中心體蛋白AZI1CD161/NK1.1/FITC  熒光素標(biāo)記兔抗、大、CD161IgG100 ul

α蛋白激酶3（心肌）CD163/M130/FITC  熒光素標(biāo)記CD163IgG20 ul

表皮型脂氧合酶3（魚(yú)鱗病相關(guān)蛋白）CD166/ALCAM/FITC  熒光素標(biāo)記活化白細(xì)胞粘附分子IgG100 ul

錨蛋白重復(fù)域28CD167a/DDR1/FITC  熒光素標(biāo)記CD167aIgG20 ul

淋巴細(xì)胞相關(guān)AF4樣蛋白CD169/Siglec-1/sialoadhesin /FITC  熒光素標(biāo)記CD169IgG100 ul

錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域蛋白12CD170/Siglec-5/FITC  熒光素標(biāo)記唾液酸結(jié)合性免疫球蛋白樣凝集素5IgG20 ul
乳酸桿菌(LB)核酸試劑盒廠(chǎng)家小鼠單核巨噬細(xì)胞，J774A.1細(xì)胞1 x 10^6 cells/T25培養(yǎng)瓶

小鼠肺上皮細(xì)胞，TC-1細(xì)胞1 x 10^6 cells/T25培養(yǎng)瓶

小鼠肝癌細(xì)胞，H22細(xì)胞1 x 10^6 cells/T25培養(yǎng)瓶

小鼠間質(zhì)細(xì)胞，TM3細(xì)胞1 x 10^6 cells/T25培養(yǎng)瓶

小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞，OP9細(xì)胞1 x 10^6 cells/T25培養(yǎng)瓶

小鼠骨髓瘤細(xì)胞，Sp2/0-Ag14細(xì)胞1 x 10^6 cells/T25培養(yǎng)瓶
檢測(cè)步驟：
一、 試劑的準(zhǔn)備
從試劑盒中取出熒光PCR反應(yīng)液(BC-qPCR MIX)、酶混合物(Enzymes MIX)，冰上融化并振蕩混勻后，10000rpm離心10s。
設(shè)所需要的PCR反應(yīng)管管數(shù)為N(N=樣本數(shù)+1管陰性對(duì)照+1管陽(yáng)性對(duì)照)，每個(gè)測(cè)試反應(yīng)體系配制如下表：
試劑 每個(gè)反應(yīng)加入的量 N個(gè)反應(yīng)加入的量
熒光PCR反應(yīng)液 14µL N×14µL
酶混合物 1 µL N×1 µL
總量 15 µL N×15µL
（1） 計(jì)算好各試劑的使用量，加入一適當(dāng)體積潔凈離心管中，充分混勻，10000rpm離心10s，向設(shè)定的N個(gè)PCR反應(yīng)管中分別加入15μL熒光PCR反應(yīng)液，向每管中加入處理后樣品或陰性對(duì)照(NTC)和陽(yáng)性對(duì)照(BC-PTC)5μL，10000rpm瞬時(shí)離心10秒。
7.2 qPCR反應(yīng)條件
將各反應(yīng)管放入定量PCR儀器的反應(yīng)槽內(nèi)。
推薦循環(huán)條件:
1循環(huán) 50℃ for 2 min
預(yù)變性 1循環(huán) 95℃ for 10 min
PCR擴(kuò)增 40循環(huán) 95℃ for 15 sec
60℃ for 60 sec
在60℃延伸時(shí)收集熒光信號(hào)。報(bào)告基團(tuán)：設(shè)置為FAM。淬滅基團(tuán)：NONE，請(qǐng)勿選擇ROX參比熒光。